Il Museo è ospitato all’interno della Porta S. Sebastiano delle mura Aureliane ed offre ai visitatori un itinerario didattico che è stato realizzato nel 1990, ma la storia dell’utilizzo del monumento per usi più o meno consoni alla sua importanza ha inizio molto tempo prima. Nel1939, nonostante il parere contrario della Ripartizione Antichità e Belle Arti, che si opponeva alla trasformazione in studio artistico del monumento, già da anni aperto al pubblico, furono eseguiti alcuni lavori negli ambienti interni della Porta per adattarli ad abitazione e studio privato del segretario del partito fascista Ettore Muti, che vi rimase dal 1941 al ‘43.
Furono ricostruiti nuovi solai poiché le volte in muratura erano crollate, creati nuovi ambienti con muri divisori, installate scale in legno e muratura, ed ancherifatte le pavimentazioni in travertino e mattoni, con l’inserzione di due mosaici al primo piano.
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Dopo la seconda guerra mondiale la Porta venne riaperta al pubblico dal Comune che diede anche inizio alla stesura di un progetto per la realizzazione di un museo delle mura. Nel corso degli anni, però, e attraverso alterne vicende una parte dei locali della Porta fu adibita ad alloggio di servizio per il custode e la sua famiglia. Il resto degli ambienti nel 1960 fu ceduto in uso al Ministero della Pubblica Istruzione, Direzione Generale alle Antichità e Belle Arti, perché vi installasse un Ufficio speciale dell’Appia Antica e poi un museo della via Appia; a tale scopo furono anche effettuati diversi lavori di trasformazione di alcuni vani, ma il previsto Ufficio non entrò mai in funzione.
L’Amministrazione comunale ritornò in possesso del monumentonel 1970, l’anno dopo la Ripartizione Antichità e Belle Arti vi allestì un piccolo Museo delle Mura collegandolo con il tratto di cammino di ronda coperto fino alla via C. Colombo. Le aperture al pubblico erano limitate alla domenica e dopo qualche anno, purtroppo, si tornò di nuovo alla chiusura totale; si deve attendere il 1984 per vedere la definitiva riapertura e sistemazione interna della porta, in occasione della mostra “Roma sotterranea”. Nel 1989 è stato ufficialmente istituitoil Museo delle Mura di Roma con Deliberazione del Consiglio Comunale, secondo la Legge Regionale del 1975, e l’anno seguente è stato inaugurato l’attuale allestimento didattico.